Putregaiul inelar al tuberculilor de cartof – depistare și diagnosticare

Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus – a fost semnalat pentru prima dată în 1914 de către Spieckermann și Kotthoff. Boala este destul de des depistată luând în calcul faptul că este o boală de carantină fitosanitară.

*Acest articol, realizat de către Valentina Iordosopol, Facultatea de Științe Agricole Silvice și ale Mediului (UTM), reflectă date referitoare la depistarea și diagnosticarea putregaiului inelar al tuberculilor de cartof la cartoful semincer importat.

Boala este prezentă în unele țări din Europa precum: Belarus, Bulgaria, Germania, Grecia, Danemarca, Letonia, Lituania, Norvegia, Polonia, Rusia, România, Slovacia, Turcia, Ucraina, Finlanda, Cehia, Suedia, Estonia.

În Asia: Kazahstan, China, Coreea, Nepal, Pakistan, Taiwan, Uzbekistan, Japonia. Pe continentul African a fost depistată în Algeria, iar în America de Nord în SUA și Canada.

Boala produce o diminuare cantitativă și calitativă a recoltei. Producția de cartofi poate să scadă mai mult din cauza golurilor pe care boala le produce în cultură și a recoltei slabe a plantelor atacate.

Tuberculii atacați nu vor fi folosiți la plantare, iar capacitatea de păstrare peste iarnă este mult mai scăzută, din cauza suprainfecțiilor cu paraziți și saprofiți secundari care desăvârșesc putrezirea. 

În urma cercetărilor efectuate în anul 2020, din totalul loturilor de cartof verificate, 90% au fost diagnosticate pozitiv cu Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicus.

Deși boala nu este periculoasă în alimentație, odată ajunsă în sol poate afecta ani la rând toată cultura. Acest lucru a determinat Agenția pentru Siguranța Alimentelor de a impune o perioadă de supraveghere a importului, timp de 3 luni, perioadă în care au fost prelevate 621 de probe din care, doar în 58 de probe, nu a fost depistată bacteria ce provoacă putregaiul inelar al cartofului.

În urma cercetărilor efectuate pe parcursul anilor 2021-2022 și a datelor obținute putem observa că rata probelor pozitive a scăzut considerabil de la 90% la 1-2%.

Acest fapt e datorat stării de carantină COVID-19, care a avut ca efect stoparea importului de cartof. De asemenea, un factor important a fost războiul din Ucraina, care a jucat rolul decisiv în importul cartofului din țările C.S.I., Ucraina, Belarus și Rusia, țări din care se importa cea mai mare cantitate de material infestat.

În anul 2023, în planul de monitorizare a tuberculilor de cartofi s-a introdus un nou agent patogen, Ralstonia Solonacearum. Acest control s-a efectuat simultan, pentru a primi pe piața internă un material semincer, cât și un cartof de consum alimentar de o calitate superioară.

Biologia și ecologia putregaiului inelar

Patografia bolii – în cazul unui material de înmulțire infectat se constată, că în unele cuiburi plantele nu răsar sau răsar mai târziu, având lăstari subțiri cu frunze mici, încrețite sau răsucite ușor de-a lungul nervurii mediane, uneori de culoare verde-gălbuie.

Plantele bolnave vegetează slab, se ofilesc, sunt clorozate. Seceta grăbește evoluția bolii. Plantele atacate formează tuberculi cu putregaiul inelar, astfel încât numărul de tuberculi cu simptome de boală este proporțional cu numărul lăstarilor atacați.

Simptome – spațiile interne ale frunzelor devin de la verde deschis până la galben pal apoi frunzele încep să se ofilească și se rulează ușor la margini.

Pe măsură ce boala progresează, frunzele devin necrotice, începând de la margini. Frunzele infectate sunt adesea reduse în dimensiune și plantele sunt ocazional pipernicite sau chiar pot muri în cele din urmă.

Agentul fitopatogen – Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Această bacterie are forma de bastonașe de 0,6-1,4×0.3-0.6 µm, atrihe la un capăt polar prezentând uneori câteva umflături, de asemenea este o bacterie Gram-pozitivă – care reține colorația violetului de gențiană în urma metodei de colorație Gram, perete celular mai gros, compus din mai multe straturi de peptidoglican.

Gram-pozitive sunt mai sensibile la acțiunea antibioticelor. Pe mediu de cultură coloniile de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus sunt mucilaginoase, albe translucide. Celulele sunt pleomorfe predominând cele solitare aranjate palisadic.

Epidemiologie – bacteriile se transmit de la un an la altul prin tuberculi și resturi vegetale. În sol, boala piere datorită antagonistului microbian.

În perioada plantării, bacteriile se propagă de la un tubercul la altul cu ocazia secționării acestora în timpul manipulării.

Contaminarea se realizează în mare măsură și toamna la recoltare, când tuberculii sănătoși vin în contact cu tuberculii bolnavi.

Toamnele ploioase facilitează infecția, deoarece în aceste condiții tuberculii se maturizează încet și cu coaja insuficient suberificată, umiditatea condiționează dezvoltarea bacteriei

Patogeneza – bacteria pătrunde prin răni și circulă prin vase până la frunze și tuberculi, unde se înmulțește, putând obtura lumenul vaselor.

Patogenul hidrolizează amidonul din tuberculi, provocând putrezirea moale a pulpei, suberul rămânând însă intact. Boala este favorizată de reacția acidă a solului, îngrășămintele potasice măresc rezistența plantelor.

Temperatura optimă a solului pentru dezvoltarea bolii este de 19-28℃. La temperaturi mai mari dezvoltarea bolii este oprită.

Materiale și metode de cercetare

Cercetarea constă în monitorizarea locală, a importului, exportului și reexportului tuberculilor prin depistarea agentului patogen Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus în condiții de laborator.

Conform E.P.P.O. PM 7/59(2), standardul de depistare a Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, pentru ca o probă să se considere pozitivă trebuie să efectuăm 4 analize de bază.

1. Imunoflourescența.
2. Creșterea bacteriei pe mediul de cultură.
3. Test de patogenitate.
4. Test biochimic.

Imunofluorescența (IF) este o tehnică de laborator pentru vizualizarea prin microscopie în ultraviolet a antigenilor sau anticorpilor localizați în celule sau țesuturi cu ajutorul anticorpilor fluorescenți.

Imunofluorescența utilizează anticorpii marcați cu un compus fluorescent (izotiocianat de fluoresceină, sulfat de rodamină) numit fluorocrom, iar preparatul microscopic după ce a fost tratat cu anticorpi fluorescenți este examinat la microscop în lumină ultravioletă.

Imunofluorescența prezintă o valoare mare diagnostică, fiind mai ieftină comparativ cu alte procedee.

Creșterea bacterii pe mediu nutritiv – Determinarea speciei de Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus la izolare se vor folosi mediile Snieszko și Bonde, D2, GYCA, King B și YPGA, care se vor incuba la 22-25℃ cel puțin 5 zile.

Coloniile sunt mucilaginoase, albe translucide. Celulele sunt pleomorfe predominând cele solitare aranjate palisadic.

Testul de patogenitate (Inoculările artificiale) – s-a efectuat inocularea artificială a probei (maceratului analizat), a martorului pozitiv și a martorului negativ (apa).

Prin observație și comparație se determină capacitatea probei analizate de a ataca planta.

Rezultatele cercetării

Experiența a constat în depistarea Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, iar conform planului de monitorizare inițial depistarea s-a efectuat printr-un test de imunoflourescență directă, iar ulterior s-a mai adăugat un test P.C.R..

Extracția bacteriilor Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus din tuberculi de cartof se efectuează cu ajutorul unui bisturiu sau al unui cuțit curat și dezinfectat corespunzător, se decojește fiecare tubercul la nivelul hilului până la apariția țesutului vascular.

Se decupează ușor de la nivelul hilului un con de țesut vascular, evitându-se pe cât posibil prelevarea de țesut parenchimatic. Conurile se prelevează în flacoane de unică folosință, în care se adaugă un volum suficient de tampon de macerare (aproximativ 40 ml) astfel încât să acopere conurile.

Fiecare flacon va conține aproximativ 200 conuri (o probă conține 200 de tuberculi). Conurile prelevate se macerează prin agitare (50 – 100 rpm), timp de 4 ore, la o temperatură mai mică de 24˚C.

După macerare, extractul de cartof se centrifughează. Se îndepărtează supernatantul fără a deranja depozitul. Se resuspendă peletul (sedimentul) în 1,5 mL tampon de sedimentare.

Etapele testului de imunofluorescență -prepararea lamelor martor pentru fiecare serie de analize se pregătesc două lame martor distincte (negativ și pozitiv) în scopul verificării procedurii analitice.

Pentru a evita contaminarea, probele și lamele martor pozitiv sunt pregătite separat. Pe lamă se notează codul probei și se marchează cu ajutorul unui marker bacteria analizată.

Se pipetează un volum standard de 20 µL extract pe o lamă cu godeuri de 6 mm diametru. Se realizează diluții ale probei  (1/10, 1/100, 1/1000) pentru ambele bacterii patogene.

Lamele se usucă la temperatura mediului ambiant sau prin încălzire la temperaturi cuprinse între 18-25ºC, într-un incubator sau placă digitală (≤ 45℃).

După uscare, celulele bacteriene se fixează prin adăugarea unui volum de aproximativ 10 µL, alcool etilic 96% în fiecare godeu, prin flambare sau prin încălzire la temperatura de 60ºC, timp  de 15 minute.

Concluzii:

1. Pe parcursul anului 2020 în cadrul monitorizării locale, importului/expotului și reexportului s-au depistat 859 de probe pozitive Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, prin imunoflourescență directă, iar probele infestate dominând importului din țările C.S.I., Belarus, Ucraina și Rusia.
2. Pe parcursul anului 2021 s-au depistat doar 4 probe pozitive prin imunoflourescență directă și un test PCR.
3. În anul 2022 s-au depistat doar 6 probe pozitive prin imunoflourescență directă și un test PCR.
4. În primele luni al anului 2023 s-au depistat 4 probe pozitive Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus prin imunoflourescență directă și un test PCR și 4 probe pozitive Ralstonia solonacearum prin imunoflourescență directă.

Bibliografie:

1. Ghorghe BOTOMAN. Bolile si daunatorii cartofului, Master Class, 2021.
2. R.A. LELLIOTT and D. STEAD. Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. Wiley -Blackwell,1987.
3. P. VIDHYASEKARAN, Concise Encyclopedia of Plant Pathology,Viva Books, New Delhi, 2004.
4. H. L. DEVASAHAYAM and L. D. C. HENRY, Illustrated Plant Pathology Basic Concepts, New India Publishing Angecy, Pitam Pura, New Delhi, 2009.
5. Valerian SEVERIN, Bolile Bacteriene ale Plantelor, GEEA, 2006.
6. Valerian SEVERIN, Ghid pentru diagnosticarea bolilor Plantelor, CERES, București, 2009.

Reglementări legale și legi, organizații:

• HG189/2010 din 17.03.2010, Cu privire la aprobarea cerinţelor minime de comercializare pentru cartofii de sămânţă. [accesat 15.03.2023].
• GUVERNUL HOTĂRÂRE Nr. 558 din 22-07-2011, Privind măsurile de urgenţă din domeniul fitosanitar pentru a preveniintroducerea şi răspîndirea în Republica Moldova a unor organisme dăunătoare plantelor, produselor vegetale şi altor bunuri conexe supuse regimului de carantină fitosanitară. [accesat 14.03.2023]. Disponibil:

Referinţe Web:

1. PM 7/59 (2) Clavibacter sepedonicus [accesat 16.03.2023]. Disponibil aici.
2. Bacterial ring rot of potato caused by Clavibacter sepedonicus: A successful example of defeating the enemy under international regulations. [accesat 10.03.2023]. Disponibil aici.
3. Clavibacter sepedonicus (potato ring rot). [accesat 12.03.2023]. Disponibil aici.

Autor: Valentina IORDOSOPOL, Facultatea de Științe Agricole Silvice și ale Mediului, departamentul  Horticultură și Silvicultură, sp. 0811. 5 – Protecția plantelor,Universitatea Tehnică a  Moldovei, or. Chișinău.

Coordonator științific: Sergiu  PANUȚA, doctor în biologie, conferenţiar universitar, Universitatea Tehnică a Moldovei.